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  雙氫青蒿素對喉癌干細胞侵襲和轉移的影響及其相關機制研究
 
  喉癌(Laryngeal cancer)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一,其發病率正在逐年上升,在東北地區喉癌能占到所有腫瘤的5.7%-7.6%。
 
  喉癌目前的治療包括手術和放化療、生物治療等多種治療手段有機的結合。
 
  但是患者的生存并沒有得到很大的改善,腫瘤的復發及轉移是患者治療失敗的主要原因。
 
  近年來,腫瘤干細胞(Cancer stem cells,CSCs)理論的提出為腫瘤轉移的研究提供了新的視角,CSCs的理論認為CSCs是存在于腫瘤內的極少數細胞,充當干細胞的角色,并具有自我更新、多向分化、高致瘤及高轉移性的特性,是腫瘤的起源。
 
  目前CSCs的研究已經有了很大的進展,在白血病以及多種實體瘤中包括喉癌中都分離出了CSCs。
 
  在本研究中,我們從CSCs的角度去分析腫瘤轉移可能的來源與機制。
 
  由于CSCs對多種化療藥物耐藥,產生抵抗,目前許多化療藥物對喉癌的治療并不十分理想。
 
  所以尋求新的抗腫瘤藥物是非常必要的。
 
  以前的研究發現,廣泛用于臨床的抗瘧藥物雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是從青蒿素中提取的倍半萜內酯類物質的衍生物,可以抑制多種腫瘤包括頭頸腫瘤的生長,具有安全、高效、副作用小等優點。
 
  但DHA對喉癌侵襲、轉移是否具有抑制作用及機制目前仍不清楚。
 
  所以,我們針對這兩大問題展開研究,通過體外和在體實驗探討介導喉癌侵襲、轉移的主要細胞及其DHA對喉癌的侵襲和轉移是否有抑制作用及其可能的機制。
 
  第一部分喉癌CSCs的分離及其體外侵襲和遷移能力的研究目的:比較喉癌Hep-2細胞系CD133~+與CD133~-細胞在侵襲轉移能力方面的差別,并探討其存在差異的機制。
 
  方法:1用流式細胞分選技術分離出細胞表面標記CD133~+及CD133~-的喉癌Hep-2細胞,分別培養后再檢測陽性細胞中CD133的陽性表達率。
 
  2應用Transwell小室這項技術檢測兩種細胞侵襲和轉移能力的差異。
 
  3 Westen blot檢測兩種細胞侵襲轉移相關蛋白MMP-9、E-cadherin的表達情況。
 
  結果:1流式細胞分選的結果:PE標記的CD133抗體染色后,流式細胞檢測顯示喉癌Hep-2細胞表面CD133的陽性表達率為3.4±0.559%,無血清培養一周后再經流式檢測CD133~+純度測定為86.5±3.011%。
 
  2 Transwell小室檢測結果顯示:兩種細胞在traswell小室的上室培養24小時后,與CD133~-細胞相比,CD133~+細胞顯示出更強的侵襲、遷移能力(P&lt;0.01)。
 
  3 Western blot結果:侵襲轉移相關蛋白MMP-9在CD133~+細胞中的相對表達量為(0.87±0.016)明顯高于CD133~-細胞(0.643±0.011),使用T檢驗的方法檢測兩組之間的蛋白相對表達量,兩者之間有顯著的統計學差異(t=20.08,P&lt;0.01)。
 
  另一種侵襲轉移相關聯的蛋白E-cadherin與MMP-9相反,在CD133~-細胞中的表達量明顯高于CD133~+細胞,兩種細胞中該蛋白的表達量分別為CD133~+(0.376±0.0200),CD133~-(0.791±0.015),T檢驗檢測兩組之間的差異有統計學意義(t=28.49,P&lt;0.01)。
 
  結論:1 CD133~+喉癌細胞較CD133~-細胞的侵襲遷移能力更強,可能是在腫瘤侵襲、轉移中的主要責任細胞。
 
  2 CD133~+細胞的高侵襲性可能與CD133~+細胞自身表達更多的侵襲轉移相關蛋白MMP-9以及丟失粘附蛋白E-caherin有關。
 
  第二部分DHA通過抑制STAT3信號途徑干擾喉癌CSCs的侵襲和遷移作用的研究目的:觀察DHA抑制喉癌干細胞侵襲轉移的作用,并探討其作為潛在的STAT3抑制劑對STAT3所激活的侵襲轉移相關信號通路的阻斷作用。
 
  方法:1將流式分選出的CD133~+細胞根據培養條件的不同分為4組:(1)無血清培養,不添加任何藥物及激活或干擾因子(對照組);(2)在(1)的基礎之上加入細胞因子IL-6(20ng/ml);(3)先加入IL-6作用1h,然后再加入DHA;(4)在(1)的基礎上只加入藥物DHA。
 
  同理,用另外一個條件低氧進行干預也分為4組:(1)單純的無血清常氧培養;(2)無血清低氧培養;(3)低氧培養的同時加入DHA;(4)無血清常氧培養再加入DHA。
 
  2用Transwell小室技術檢測上述不同培養條件下CD133~+細胞的侵襲轉移數量的變化。
 
  3 Western blot檢測上述不同條件(IL-6和低氧)激活STAT3,以及再加入DHA后,HIF-1α(乏氧條件下),STAT3,p-STAT3以及侵襲轉移相關蛋白MMP-9、E-cadherin的表達情況。
 
  結果1 Transwell結果:(1)在IL-6和/或DHA外加因素作用后,喉癌干細胞轉移的結果顯示:未處理組即對照組(162±13)個/HP,IL-6組(310±13)個/HP,IL-6+DHA組(57±9)個/HP,DHA組(48±6)個/HP。
 
  應用單因素方差分析檢測四組之間的差異有統計學意義(F=1184,P&lt;0.01),應用Tukey’s multiple comparison test方法比較組內兩兩的差別,IL-6組和對照組相比(q=41.92,P&lt;0.01),IL-6組和IL-6+DHA聯合組比較(q=71.28,P&lt;0.01),對照組和DHA組相比較(q=32.06,P&lt;0.01)。
 
  四組喉癌干細胞侵襲的結果:對照組(107±3)個/HP,IL-6組(204±7)個/HP,IL-6+DHA組(44±7)個/HP,DHA組(30±7)個/HP方差分析四組之間的差異均有統計學意義(F=1453,P&lt;0.01),IL-6組和對照組相比(q=46.68,P&lt;0.01),IL-6組和IL-6+DHA聯合組比較(q=76.79,P&lt;0.01),對照組和DHA組相比較(q=37.11,P&lt;0.01)。
 
  (2)在低氧和/或DHA作用后,各組喉癌干細胞經Traswell轉移的結果示:常氧組(137±9)個/HP,低氧組(229±7)個/HP,低氧+DHA組(59±4)個/HP,常氧+DHA組(39±5)個/HP。
 
  四組之間單因素方差分析結果顯示四組之間的差異有統計學意義(F=1675,P&lt;0.01),各組之間的比較如下:常氧組和低氧組(q=43.68,P&lt;0.01),低氧組和低氧+DHA組(q=80.57,P&lt;0.01),常氧組和常氧+DHA組(q=46.32,P&lt;0.01)。
 
  四組細胞Transwell侵襲的結果示:常氧組(122±10)個/HP,低氧組(190±7)個/HP,低氧+DHA(58±6)個/HP,常氧+DHA(39±7)個/HP,四組之間比較經統計學分析四組之間的差異有統計學意義(F=705.9,P&lt;0.01),常氧組和低氧組(q=26.35,P&lt;0.01),低氧組和低氧+DHA組(q=51.35,P&lt;0.01),常氧組和常氧+DHA組(q=32.19,P&lt;0.01)。
 
  2 Western blot結果:(1)在IL-6和/或DHA作用于喉癌干細胞后,Western blot檢測相關蛋白p-STAT3,STAT3,以及侵襲轉移相關蛋白MMP-9,E-cadherin在四組中的表達量的變化,使用單因素方差分析對結果統計。
 
  STAT3在四組中的表達量無明顯差別,無統計學意義(P&gt;0.05)。
 
  p-STAT3在四組中表達量的差異有統計學意義(F=10190,P&lt;0.01),組內兩兩之間進行比較,IL-6作用后較對照組的表達量增加(q=20.87,P&lt;0.01),加入DHA后,IL-6+DHA組較IL-6組的蛋白量又明顯減少(q=183.5,P&lt;0.01),與照組相比該蛋白在DHA組的表達量也明顯下降(q=165,P&lt;0.01)。
 
  MMP-9的表達趨勢變化與p-STAT3相似,四組之間的差異同樣有統計學意義(F=7830,P&lt;0.01),四組之間進行比較,在IL-6組表達最多,與對照組相比有統計學意義(q=51.5,P&lt;0.01),而IL-6+DHA組與IL-6組相比,MMP-9的表達量明顯下降(q=143.7,P&lt;0.01),單獨加DHA與對照組相比也明顯下降了(q=232.9,P&lt;0.01)。
 
  E-cadherin的變化趨勢則與上述兩種蛋白相反,四組之間的差異仍有統計學意義(F=1219,P&lt;0.01),IL-6作用后表達量反而降低,與對照組相比差異有統計學意義(q=9.845,P&lt;0.01)。
 
  該蛋白在IL-6+DHA組較IL-6組的表達水平明顯升高,差異明顯,有統計學意義(q=59.85,P&lt;0.01)。
 
  DHA單獨組和對照組比較,E-cadherin的表達水平升高差異也有統計學意義(q=59.53,P&lt;0.01)。
 
  (2)喉癌干細胞低氧和/或DHA作用后,Western blot檢測相關蛋白乏氧因子-1α(HIF-1α),p-STAT3和STAT3以及侵襲、轉移相關蛋白MMP-9和E-cadherin的表達量變化。
 
  用單因素方差分析對結果進行統計、評定。
 
  HIF-1α在四組中的表達的差異同樣有統計學意義(F=350.9,P&lt;0.01)。
 
  低氧培養后,HIF-1α的表達量明顯升高,與對照組相比有統計學意義(q=28.32,P&lt;0.01)。
 
  加入DHA后其表達量顯著下降,低氧+DHA組比低氧組明顯減少(q=8.26,P&lt;0.01),且DHA組和對照組比較表達量也顯著降低(q=12.80,P&lt;0.01)。
 
  p-STAT3和MMP-9的表達趨勢與HIF-1α相似,四組之間的差異也有統計學意義(F=2187,P&lt;0.01,p-STAT3;F=4833,P&lt;0.01,MMP-9),在低氧培養后均升高,表達量與相應的對照組比較均有統計學意義,p-STAT3(q=34.68,P&lt;0.01),MMP-9(q=45.31,P&lt;0.01)。
 
  同樣,在加入DHA后,與相應的對照組比較,這兩種蛋白的表達量顯著下降,差異有統計學意義,常氧組和常氧+DHA組相比p-STAT3(q=63.68,P&lt;0.01),低氧和低氧+DHA組相比p-STAT3(q=90.30,P&lt;0.01),常氧組和常氧+DHA組相比MMP-9(q=115.7,P&lt;0.01),低氧組和低氧+DHA組比較MMP-9(q=99.39,P&lt;0.01)。
 
  STAT3在四組的表達水平無明顯差異(P&gt;0.05)。
 
  E-cadherin在四組中的差異也有統計學意義(F=17730,P&lt;0.01)。
 
  低氧條件下較常氧時表達增高,差異有統計學意義(q=8.848,P&lt;0.01)。
 
  而加入DHA后其相應的對照組E-cadherin的表達水平呈現升高的趨勢,差異有統計學意義,常氧組和常氧+DHA組比較(q=258.7,P&lt;0.01),低氧組和低氧+DHA組比較(q=196.1,P&lt;0.01)。
 
  結論:1 IL-6和低氧的作用可以提高喉癌干細胞的侵襲、遷移能力。
 
  2 DHA可以抑制喉癌干細胞的侵襲和轉移,其機制可能與DHA特異性的抑制p-STAT3的激活,從而使得其下游的侵襲轉移相關蛋白的表達受到影響。
 
  第三部分人喉癌Hep-2細胞系的CD133~-和CD133~+細胞在體內侵襲和轉移能力的對比研究目的:比較CD133~-和CD133~+細胞在體內的侵襲、轉移的差異,并檢測侵襲、轉移相關蛋白的表達,分析可能的機制。
 
  方法:1將裸鼠隨機分為2組,分別通過尾靜脈注射CD133~-和CD133~+細胞建立轉移模型。
 
  觀察小鼠的一般情況,并記錄小鼠生存時間。
 
  2對各組肺組織HE染色,觀察并計數各組肺組織所形成的轉移灶數目。
 
  3 Western blot檢測兩組肺轉移灶中侵襲、轉移相關蛋白的表達情況,分析可能的機制。
 
  結果:1小鼠的一般情況:我們所建立的小鼠的侵襲、轉移模型對小鼠的一般情況影響較大,尾靜脈注射腫瘤細胞后隨著時間延長肺轉移灶逐漸形成的過程中,一部分小鼠的體重出現了相應的變化,在生長期出現了體重下降。
 
  CD133~-細胞組的小鼠在第31天有2只開始出現體重下降,第33天有3只開始出現體重下降。
 
  CD133~+細胞組的小鼠在第19天有3只,第21天有2只,29天有1只小鼠開始出現體重逐漸下降。
 
  在體重下降后,小鼠的活動、精神狀態等也逐漸開始減低。
 
  但兩組體重之間的差異無統計學意義。
 
  2 CD133~-和CD133~+細胞分別建立的轉移模型中肺轉移的情況的比較:CD133~-細胞組肺組織轉移程度較輕,肉眼觀察肺組織紅潤,表面光滑,而CD133~+細胞組的肺組織表面可見明顯轉移結節形成,肺組織略顯蒼白。
 
  經HE染色后,鏡下觀察兩組肺組織,與CD133~-細胞組相比,CD133~+細胞組肺轉移灶明顯較大,且數量多。
 
  經T檢驗兩組肺轉移灶數目有統計學差異(t=2.615,P&lt;0.05)。
 
  3比較CD133~-和CD133~+細胞在體內所建立的肺轉移模型對小鼠生存的影響:CD133~-細胞組小鼠在尾靜脈注射細胞后第34天、36天分別有1只小鼠出現毫無征兆的死亡,生存率分別為85.71%和71.43%。
 
  在第39天有3只小鼠突然出現死亡,最終生存率為28.57%。
 
  按照執行安樂死及實際死亡小鼠進行計算,CD133~+細胞組在第29天,31天和34天分別有1只小鼠死亡,生存率分別下降為85.71%,71.43%和57.14%。
 
  第39天有3只小鼠死亡,最終生存率為28.57%。
 
  應用Kaplan-Meier法對數據進行整理分析,Log-rank test方法對兩組生存情況進行比較,得出P&gt;0.05,兩組之間生存的差異沒有統計學意義。
 
  4 CD133~-和CD133~+細胞組轉移瘤在侵襲、轉移相關蛋白表達的比較:實驗結束后,Western blot檢測轉移瘤中侵襲轉移相關蛋白的表達,結果:p-STAT3在兩組中的表達有明顯的差別,CD133~+細胞組的相對表達量為1.70±0.05,明顯高于CD133~-細胞組(0.83±0.30),經T檢驗,兩組之間的差異有統計學意義(t=4.879,P&lt;0.01)。
 
  而STAT3在兩組之間的表達量無明顯差異。
 
  侵襲相關蛋白MMP-9在兩組轉移瘤中的相對表達量也有明顯的差異,CD133~+細胞組為1.74±0.51,明顯高于CD133~-細胞組(0.47±0.15),兩組的差異有統計學意義(t=4.168,P&lt;0.05)。
 
  另一種轉移相關蛋白E-cadherin在兩組之間的相對表達水平則與MMP-9相反,CD133~+細胞組為0.86±0.14,明顯低于CD133~-細胞組,兩組之間的差異有統計學意義(t=4.241,P&lt;0.05)。
 
  結論:1與CD133~-細胞相比,CD133~+細胞更易在體內發生侵襲、轉移,我們推測CD133~+細胞可能是介導腫瘤侵襲、轉移的主要細胞。
 
  2 CSCs中STAT3的組成性激活可以導致下游侵襲、轉移相關蛋白MMP-9的表達增高,E-cadherin的表達降低,使細胞獲得更強的侵襲和轉移的能力。
 
  第四部分DHA對喉癌CSCs侵襲和轉移的影響及其機制的在體實驗研究目的:檢測DHA對腫瘤侵襲、轉移的抑制作用,并通過檢測侵襲、轉移相關蛋白表達的變化,探究可能的機制。
 
  方法:1將14只BALb/c雄性裸鼠均經尾靜脈注射CD133~+細胞建立體內轉移模型。
 
  將裸鼠隨機分為2組,對照組和實驗組。
 
  實驗組給予DHA(100mg/Kg),對照組給予DMSO。
 
  觀察并記錄小鼠的一般情況以及小鼠的生存時間。
 
  2對兩組小鼠的肺組織進行HE染色,觀察并計數兩組所形成的肺轉移灶。
 
  3應用Western blot檢測兩組小鼠肺轉移灶中侵襲、轉移相關蛋白的表達情況,并分析DHA對小鼠體內侵襲轉移影響的可能機制。
 
  結果:1小鼠的一般情況:對照組的小鼠分別在第9天、17天、25天,分別有1只小鼠開始出現體重下降,另2只均在第53天開始出現體重下降,其中1只在第59天體重下降了25%。
 
  另外1只小鼠雖然體重下降未達到原體重的20%,但出現反應遲鈍、跛行、退縮等反應。
 
  實驗組有1只小鼠在第23天突然出現體重下降,精神欠佳等。
 
  兩組之間體重的差異無統計學意義。
 
  2 DHA可以抑制肺部轉移灶的形成:實驗結束后,對比觀察兩組的肺組織,對照組肺組織顏色蒼白,表面有大量的轉移灶,而實驗組肺組織顏色紅潤,肺表面轉移灶明顯少于對照組。
 
  對肺組織進行HE染色,并對兩組肺部所形成的轉移灶分別進行計數和統計學分析,得出兩組差異有統計學意義(t=2.940,P&lt;0.05)。
 
  3應用DHA后對小鼠生存的影響:對照組在第12天、24天、29天分別出現1只小鼠死亡,生存率分別下降為85.71%,71.43%,57.14%。
 
  第59天有2只小鼠死亡,最終生存率為28.57%。
 
  而實驗組僅在第29天出現1只小鼠死亡,其余小鼠精神狀態及飲食情況未見明顯變化,均存活至少59+天,總生存率為85.71%。
 
  Kaplan-Meier法對兩組的生存情況進行整理分析,并用Log-rank test方法對兩組的生存進行比較,得出實驗組的生存率明顯高于對照組(P&lt;0.05)。
 
  4 DHA的應用對腫瘤侵襲、轉移相關蛋白的影響:我們通過Western blot方法分析兩組肺轉移灶侵襲、轉移相關蛋白的表達情況。
 
  P-STAT3在實驗組的相對表達量(0.235±0.059)明顯低于對照組(1.063±0.222)。
 
  經T檢驗,兩組的表達水平差異明顯(t=6.248,P&lt;0.01)。
 
  STAT3在兩組中的表達量無明顯差異。
 
  侵襲相關蛋白MMP-9在實驗組的表達水平為0.300±0.033,明顯低于對照組(0.926±0.289)。
 
  兩組之間的差異有統計學意義(t=3.731,P&lt;0.01)。
 
  而轉移相關蛋白E-cadherin在加入DHA后的表達水平為(1.305±0.319),顯著高于對照組(0.737±0.138)。
 
  結論:1 DHA可以顯著抑制腫瘤在體內的侵襲、轉移,與對照組相比,DHA還能顯著提高小鼠的生存時間。
 
  2 DHA可能是通過抑制STAT3的磷酸化而使得其下游的侵襲和轉移相關蛋白MMP-9的表達下降,E-cadherin表達上調,從而達到抑制腫瘤侵襲、轉移的目的。

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