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  骨髓間充質干細胞對博萊霉素致大鼠肺纖維化治療的研究
 
  1.研究背景和目的骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能,能促進間充質組織的再生。
 
  BMSCs在骨髓中含量極低,而組織工程需要大量的種子細胞,從動物骨髓分離BMSCs的難度在很大程度上限制了許多實驗的開展。
 
  因此,建立一種持續、穩定、可多向分化的骨髓間充質干細胞體外分離培養體系對細胞的體內、體外實驗及組織工程至關重要。
 
  本實驗擬通過分離、培養、純化SD大鼠BMSCs,誘導其向成脂細胞、成骨細胞分化,并對其細胞表面標志物進行初步鑒定,希望建立一種理想的大鼠骨髓間充質干細胞體外培養擴增體系,為組織工程尋找良好的種子細胞提供實踐基礎。
 
  2.材料和方法2.1 BMSCs的分離、培養:取6-8周齡SD大鼠10只,清潔級,大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉,75%酒精浸泡10分鐘。
 
  無菌條件下取下脛骨及股骨,PBS液洗3次。
 
  剪去脛骨和股骨的干骺端,暴露骨髓腔,用無菌PBS液反復沖洗骨髓腔;將沖出的骨髓制成單細胞懸液,1200rpm離心5分鐘,棄去上清,重懸,以3-4×105個細胞/cm2接種于25cm2的培養瓶中,然后置于37℃、5%CO2培養箱中培養。
 
  2.2 BMSCs的培養、純化及傳代:原代培養過程中,48-72小時全量更換培養液,以后每隔2-3天更換培養液。
 
  待細胞鋪滿瓶底至細胞融合成單層,長至80%-90%密度融合時,用0.25%胰酶消化,按照1:2進行傳代培養。
 
  2.3 BMSCs形態學觀察:倒置相差顯微鏡每日觀察細胞形態變化及生長狀況,拍照記錄。
 
  2.4 BMSCs的鑒定2.4.1 BMSCs的定向誘導分化:選擇P3代BMSCs,于6孔細胞培養板上接種BMSCs(5×103個細胞/cm2),待細胞貼壁生長至密度達80%時,加入成骨或成脂細胞誘導液,每2-3天換液1次,以未加誘導液的細胞培養孔作為對照。
 
  分別在誘導的第21天和第14天,對誘導分化的成骨細胞及脂肪細胞分別行茜素紅和油紅O染色。
 
  2.4.2流式細胞儀檢測細胞表面標志物:收獲生長狀態良好的P3代細胞,0.25%胰酶消化,1200rpm離心5分鐘,PBS液洗滌細胞2次,重懸,計數細胞,各管分別加入CD29、CD90、CD34單克隆抗體,同時每管樣品設立同型陰性對照。
 
  室溫避光孵育30分鐘,PBS液洗滌去除未結合抗體,再用PBS液重懸細胞,流式細胞儀進行檢測。
 
  3.研究結果3.1 BMSCs形態學觀察骨髓細胞接種于培養瓶后,細胞呈圓型,大小不一,懸浮于培養液中。
 
  24小時后部分細胞開始貼壁生長,呈圓形、梭形或多角形。
 
  通過換液去除未貼壁的雜質細胞。
 
  48-72小時后可見放射狀排列的細胞集落,梭形細胞為主。
 
  3-5天后細胞呈集落生長,融合80%-90%。
 
  12-14天細胞排列緊密,逐漸融合成片。
 
  消化傳代后,傳代細胞24小時完全貼壁生長。
 
  細胞呈梭形生長,生長旺盛。
 
  4-5天傳代1次,可穩定連續傳代10代以上,細胞形態及生長速度無明顯變化。
 
  3.2 BMSCs成骨誘導分化鑒定大鼠P3代BMSCs經成骨誘導劑誘導第21天行茜素紅染色,可見紅染的鈣結節,結節中心透光度較差,四周輪廓模糊,呈淡紅色的暈輪區。
 
  3.3 BMSCs成脂誘導分化鑒定大鼠P3代BMSCs經成脂誘導劑誘導第14天,細胞內脂滴大量形成、合并呈串珠狀。
 
  油紅O染色為陽性,細胞內脂滴呈橘紅色。
 
  3.4流式細胞儀檢測結果培養的P3代大鼠BMSCs均一表達CD29,CD90,陽性率分別為93.160%,86.94%;而CD34呈陰性表達,陽性率分別為1.65%和1.57%。
 
  4.結論本研究采用全骨髓貼壁法結合密度梯度離心法分離的大鼠BMSCs在形態學與生長動力學上均符合骨髓間充質干細胞的特征。
 
  在成骨、成脂誘導培養條件下,分別出現成骨、成脂表型特征,說明其可向這兩種細胞分化,并通過細胞表達一些特異性表面抗原,證實了本研究分離培養的細胞具有骨髓間充質干細胞的特異性,獲得了數量足、純度高、增殖能力強且生物學特征穩定的BMSCs,為組織工程提供充足的種子細胞打下堅實的基礎。
 
  第二部分博萊霉素致大鼠肺纖維化模型的建立方法及比較1.研究背景和目的肺纖維化(PF)的病理特點為肺部炎癥導致肺泡反復、持續性損傷及細胞外基質反復破壞、修復和過度沉積。
 
  該病預后極差、嚴重影響患者生存質量,病程一般呈進行性發展,最終引起呼吸功能衰竭而死亡。
 
  近年來,PF的發病率呈上升趨勢。
 
  由于該病發病機制尚不清楚,臨床上缺乏有效的治療方法,病死率較高,因此建立可靠而穩定的PF動物模型是探索其發病機制和開發有效治療藥物的重要保障。
 
  目前用于復制PF模型所采用的動物主要是嚙齒類動物。
 
  常用的PF誘導劑主要包括博萊霉素(BLM)。
 
  用BLM制作的肺纖維化模型,其生理學改變和病理組織學變化與人類PF近似,因此成為復制PF模型的常用藥物。
 
  目前,采用不同方式、不同動物經多種途徑給藥建立的PF模型逐漸增多,均可成功建立PF模型。
 
  但是,不同給藥方法所致模型的病理改變與人的病理變化及病變部位卻不很相符,如何改進方法促使模型病變部位接近人類是亟待解決的重要問題。
 
  本研究擬選用BLM作為誘導劑,分別經腹腔、氣管給藥誘導大鼠發生PF,動態觀察兩種大鼠PF模型肺組織形態學與羥脯氨酸含量等的變化,以探討一種更近似于人類PF病程的動物模型建立方法。
 
  2.材料和方法健康雄性SD大鼠80只,分別經氣管、腹腔給予BLM誘導大鼠肺纖維化。
 
  隨機分為①氣管給藥模型組(model A):一次性氣管內注入博萊霉素(5mg/kg),分別于給藥后第7、14、21天活殺10只,為model A7、modelA14、model A21組;②氣管給藥對照組(control A):大鼠在相同條件下經氣管注入等量生理鹽水,余同model A組,于第21天活殺10只;③腹腔給藥模型組(]model B):大鼠每日左下腹腔注射博萊霉素(15mg/kg),連續5天。
 
  分別于給藥后第7、14、21天活殺10只,為model B7、model B14、model B21組;④腹腔給藥對照組(control B):每日腹腔內給予等量生理鹽水,余同model B組,于第21天活殺10只。
 
  實驗期間,每天觀察各組動物的行為狀態并記錄體重變化。
 
  實驗結束時取下雙側肺組織,測定肺組織濕干重比(W/D);HE染色進行肺組織病理學觀察及測定肺損傷定量評價指標(IQA),CMIAS-B真彩色病理圖像分析系統在400倍下測定胸膜及肺泡間隔厚度;堿水法測定肺組織羥脯氨酸(HYP)含量;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定肺泡灌洗液TNF-α、IL-6的含量;免疫組化檢測轉化生長因子-β(TGF-p)蛋白的表達水平。
 
  3.研究結果3.1各組大鼠起始體重并無差別。
 
  給予博萊霉素后,大鼠的體重值均有降低(P均&lt;0.01)。
 
  3.2與對照組相比,給藥大鼠W/D、IQA值均有升高(P均&lt;0.01);腹腔給藥組與氣管給藥組相同時相點比較,W/D、IQA值明顯降低(P&lt;0.05或P&lt;0.01)。
 
  3.3肺組織羥脯氨酸(HYP)含量變化:兩種大鼠模型HYP含量均自第7、14天開始升高,第21天達高峰,腹腔給藥組大鼠HYP含量明顯高于氣管給藥組(P&lt;0.01)。
 
  3.4肺泡灌洗液檢測結果:與對照組相比,各給藥組大鼠肺泡灌洗液中TNF-a與IL-6的含量均明顯增加(P&lt;0.05或P&lt;0.01),且隨時間的延長含量也逐漸增多。
 
  與氣管給藥組相同時相點比較,腹腔給藥組肺組織TNF-a與IL-6的含量明顯上調(P&lt;0.05或P&lt;0.01)。
 
  3.5免疫組織化學結果:與對照組相比,給藥組大鼠肺小靜脈TGF-β的含量均明顯增加(P&lt;0.01),且隨時間的延長TGF-β的含量也逐漸增多(P&lt;0.01),至給藥后第21天達高峰。
 
  與氣管給藥組相同時相點比較,腹腔給藥組肺小靜脈TGF-β蛋白表達明顯增強(P&lt;0.05),陽性細胞主要分布于肺泡上皮細胞及肺血管內皮細胞。
 
  3.6肺組織切片HE染色光鏡下觀察發現,對照組大鼠肺泡壁完整,肺泡間隔未增厚;BLM處理組第7天可見大量炎癥細胞浸潤,組織水腫;第14天肺泡間隔增寬,結構紊亂,出現纖維化病灶;第21天肺泡結構破壞嚴重,細胞外基質大量沉積,形成廣泛纖維化。
 
  氣管給藥組大鼠肺泡壁厚度較腹腔給藥組大鼠增厚明顯(P&lt;0.05);腹腔給藥組大鼠胸膜較氣管給藥組明顯增厚(P&lt;0.01)。
 
  3.7肺組織切片電鏡下肺組織超微結構顯示,BLM處理組肺微小動脈,微小靜脈及毛細血管的內皮和基底膜有不同程度的損害;肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細胞均有不同程度的損傷。
 
  3.8肺組織HYP與W/D、IQA之間存在顯著的正相關關系(r分別為0.418,0.849,P均&lt;0.01);HYP與TNF-α、IL-6和TGF-β蛋白之間亦存在非常顯著的正相關關系(r分別為0.833,0.882,0.861,P均&lt;0.01)。
 
  4.結論4.1本研究分別通過氣管和腹腔給予BLM,可致大鼠肺組織結構破壞,呈現典型的肺纖維化病變,兩種給藥方法均可成功制備博萊霉素致大鼠PF動物模型。
 
  4.2 BLM誘導大鼠肺纖維化過程中,可能通過促進肺組織中TNF-α、IL-6和TGF-β的產生,引起炎癥介質對支氣管肺泡上皮及血管內皮細胞的損傷和異常修復,破壞肺泡-毛細血管膜的完整性,刺激成纖維細胞異常增殖和膠原合成增加,從而促進肺部炎癥反應和肺纖維化的發病。
 
  4.3腹腔給藥具有操作快捷、簡便、死亡率低、個體間差異小等優點,可以降低因手術操作熟練程度不同而造成動物纖維化程度的差異;且腹腔給藥引起膠原代謝紊亂程度重、形成的病變主要位于胸膜下,與人類IPF的影像學表現接近。
 
  腹腔內給藥誘導動物發生PF可能是較為理想的模型制作方法。
 
  第三部分骨髓間充質干細胞對博萊霉素致大鼠肺纖維化干預效應的研究1.研究背景和目的特發性肺纖維化(IPF)是一種病因不明、以普通型間質性肺炎(UIP)為特征性病理改變的一種慢性、進行性肺間質疾病。
 
  該病進行性加重,最終導致呼吸功能不全而死亡。
 
  臨床上除肺移植外尚無其它有效治療方法。
 
  但由于諸多因素限制,許多患者不能或不適合接受肺移植術,故此方法實際難以在臨床上得到廣泛開展。
 
  因此,探索一種能在臨床具有實用前景的IPF治療方法具有重要意義。
 
  越來越多的研究表明氧化應激與IPF的形成和發展有著密切關系。
 
  當肺內產生過多的ROS時就會導致氧化應激,繼而引起不同程度的肺損傷。
 
  肺臟作為體內最重要的器官之一,由于其獨特的解剖結構和外界相通的特性,決定了肺是體內最易受到氧化應激攻擊的靶器官。
 
  因此,研究氧化應激致IPF的作用機制對于IPF的預防和治療具有重要意義。
 
  機體內氧化還原水平失衡是眾多疾病的病理生理基礎。
 
  Nrf2作為細胞抗氧化應激反應的核心轉錄因子,能夠激活機體內源性抗氧化應答,保護細胞抵抗各種內源性應激和環境應激。
 
  Nrf2如果出現功能障礙,可加重氧化應激源的毒性,導致細胞出現各種功能障礙甚至死亡。
 
  大量的研究證實Nrf2-ARE信號通路及其下游基因在抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤、抗凋亡和神經保護等方面發揮重要的保護功能。
 
  由此,我們提出如下假說:第一,Nrf2-ARE通路在保護肺組織細胞抵抗氧化損傷中發揮重要作用;第二,IPF患者肺組織細胞中Nrf2-ARE通路可能存在異常,導致其對氧化應激更為敏感。
 
  由于干細胞可能具有修復組織損傷的潛力,故而近年來干細胞療法成為PF治療中的一個熱門研究課題。
 
  本研究擬腹腔內少量多次注射BLM制備PF動物模型,通過尾靜脈輸注BMSCs,使其定植于受損肺組織,分別從動物、器官、細胞及分子水平觀察BMSCs對PF的治療作用及其可能機制,為臨床防治IPF提供實驗理論依據。
 
  2.材料和方法體外分離、培養SD大鼠BMSCs,傳至第四代用于實驗。
 
  40只SD大鼠隨機分為4組:陰性對照組(Control組)、肺纖維化組(BLM組)、間充質干細胞治療組(BLM+BMSC組)和間充質干細胞對照組(BMSC組),每組各10只大鼠。
 
  BLM組每日左下腹腔內注射博萊霉素(15mg/kg),連續5天,制備肺纖維化模型;BMSC+BLM組于博來霉素注射后立即經尾靜脈注入大鼠BMSCs懸液(2×106/1.5m1),連續5天;BMSC組經腹腔注入等量生理鹽水,余同BMSC+BLM組;Control組作為陰性對照,經腹腔注入等量生理鹽水后,未給予其他處理。
 
  各組大鼠分別于造模后第21天處死。
 
  取肺組織檢測肺濕干重量比(W/D);分別用HE染色和MASSON染色進行肺組織病理學觀察;堿水法測定肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量;分別用硫代巴比妥酸(TBA)法、黃嘌呤氧化酶法檢測血漿丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力;Western-blot檢測肺組織中Nrf2、NQO1、HO-1、y-GCS蛋白的表達。
 
  3.研究結果3.1與Control組比較,BLM組和BLM+BMSC組W/D值和HYP含量明顯升高,有顯著性差異(P&lt;0.01);與BLM組大鼠比較,BLM+BMSC組W/D值與HYP含量明顯降低(P&lt;0.01)。
 
  3.2 HE和MASSON染色顯示BMSCs顯著降低大鼠肺泡炎和肺纖維化的程度。
 
  3.3生化指標檢測顯示:與Control組相比,BLM組大鼠血漿SOD活性顯著降低(P&lt;0.01),MDA含量顯著增高(P&lt;0.01);與BLM組相比,間充質干細胞治療組大鼠血漿SOD活性明顯上調,MDA含量顯著降低(P&lt;0.01)。
 
  3.4 Western-blot結果顯示:與Control組比較,BLM組大鼠肺組織Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白表達水平均明顯升高(P均&lt;0.01);與BLM組比較,BLM+BMSC組大鼠肺組織中Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白的表達水平進一步上調(P&lt;0.05或P&lt;0.01)。
 
  3.5相關性分析結果顯示:Nrf2蛋白和NQO1、HO-1、γ-GCS蛋白存在顯著的正相關關系(r分別為0.847,0.924,0.957,P均&lt;0.01)。
 
  4.結論4.1 BLM誘導的大鼠肺纖維化模型中,氧化應激反應增強,激活了機體內源性抗氧化信號通路Nrf2-ARE。
 
  肺纖維化大鼠肺臟存在明顯的氧化應激損傷和抗氧化應激反應。
 
  激活的Nrf2-ARE通路及下游Ⅱ相解毒酶HO-1、y-GCS和NQO1的表達,發揮了內源性抗氧化應激和解毒的功效。
 
  但是,這種代償保護作用非常有限,并不能徹底改變肺纖維化病程中氧化應激狀態的存在。
 
  4.2 BMSCs的移植可顯著提高肺纖維化大鼠Nrf2的含量,進而促進下游保護性蛋白HO-1、γ-GCS和NQO1的表達,清除ROS,抑制肺組織氧化應激反應,由此減輕損傷肺組織中成纖維細胞的增生,對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化具有積極的保護作用。

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